مقاله شرايط بحراني در تعيين فيبرهاي محلول در شويندهها
دانشگاه صنعتي اصفهان
آزمايشگاه علوم دامي ، بخش تجزيه خوراک
شرايط بحراني در تعيين فيبرهاي محلول در شويندهها
منبع :
Mertans, D.R. 1992. Critical Conditions Inin
Determining Detergent Fibers. Proc. NTFA Foroge Analysis workshop, Sept 16-17,
Denevor, Co.pp 1-8
چكيده:
فيبر يك واژه منحصر بفرد تغذيهاي است كه سعي ميشود بر اساس روشهاي محلوليت شيميايي تعيين شود. از آنجا كه هيچ ارتباط مستقيمي بين محلوليت و فراهمي تغذيهاي وجود ندارد، روشهاي مورد استفاده براي جداسازي فيبر، آن را تعريف خواهد كرد. اين به آن معني است كه روشهاي فيبر بايستي به دقت انجام شوند تا مقاديري بدست آيد كه معتبر و قابل انتشار باشند. متاسفانه آزمايشگاهها بعضي مواقع روشهاي فيبر را جهت راحتي يا سرعت كار، بدون توجه به اين تغييرات روي نتايج، تغيير ميدهند. بعضي از شرايط و مراحل هستند كه در روشهاي تعيين فيبر جهت دستيابي به نتايج دقيق حياتي هستند. از بين اينها ميتوان، نمونهبرداري، خشككردن، آسياب كردن (اندازه ذرات نمونه)، مقدار نمونه، استانداردكردن محلولها، خارج كردن نشاسته و آلودگي ازته، زمانبندي و دماي جوش، انتقال پسمانده، شستن پسماندههاي فيبري، نوع مجاري فيلتراسيون و روش توزين را نام برد. بعضي از نمونهها در روش NDF به سختي فيلتر ميشوند. تغييراتي پيشنهاد شده است كه به فيلتراسيون نشاسته، پكتين و نمونههاي حاوي چربي كمك ميكند.
مقدمه:
فيبر يك اصطلاح تغذيهاي منحصر بفرد است كه ميتوان آن را به عنوان اجزاء غيرقابل هضم يا آهسته – هضم خوراك كه در دستگاه گوارش حيوان فضايي را اشغال ميكند، تعريف کرد. از نظر شيميايي، اين اجزاء مخلوط متغيري از سلولز، هميسلولز، بعضي پكتينها و ليگنين به علاوه پروتئين ها و ليپيدهاي غيرقابل هضم هستند. اين تعريف تغذيهاي از فيبر نشان از آن دارد كه ميتوان مقدار صحيح آن را تنها توسط حيوان اندازهگيري كرد. ليكن، تغذيهدانان نياز به يك روش عملي و مناسب براي اندازهگيري فيبر داشته و بايستي بين مفاهيم تئوريك فيبر و استفاده از محلوليت شيميايي جهت جداسازي و اندازهگيري بخشهايي كه شباهت بسيار زيادي به موادي دارند كه از نظر تغذيهاي فيبر گفته ميشود، يك سنخيت ايجاد كنند. از آنجا كه هيچ تضميني براي تناسب مستقيم بين محلوليت شيميايي و فرآهمي تغذيهاي وجود ندارد، در واقع فيبر با استفاده از روش جداسازي آن تعريف ميشود. تعريف واقعي فيبر به روش آن بستگي دارد و اين روشن ميسازد چرا اينقدر روشهاي آناليز فيبر زياد است (فيبر خام، فيبر نامحلول در شوينده اسيدي، فيبر نامحلول در شوينده خنثي، فيبر نامحلول در شوينده خنثي و آميلاز، فيبر رژيمي). فراواني روشهاي فيبر با تغييرات هر روش (كه معمولاَ هم انجام می شود) پيچيدهتر ميشود. بعضي اوقات اين تغييرات جهت برآورد نيازهاي خاص موجود در يك كار يا پروژه صورت ميگيرند. مواقع ديگر تغييرات براي راحتي يا افزايش سرعت آناليز فيبر انجام ميشوند. از آنجا كه فيبر با روش جداسازي آن تعريف ميشود، واضح است كه اين تغييرات ميتوانند يك مقدار جديد براي فيبر به دست آورند كه قابل مقايسه با روش اصلي نباشد. حساسيت مقادير بدست آمده به روش اندازهگيري فيبر، تاكيد ميكند كه از روشهاي فيبر بايستي دقيقاَ پيروي كرد تا واقعاَ قابل انتشار باشند. جهت قابل قبول بودن، هرگونه تغيير در روشهاي فيبر بايد به دقت با چندين نمونه خوراكي كه نماينده هر نوعي از اجزاء خوراك باشند، مورد ارزيابي قرار گيرد. هدف اين مقاله بحث در مورد بعضي مراحل و شرايط حياتي در آناليز فيبر محلول در شوينده و بيان مسائل ذاتي تغيير اين روشهاست.
عواملي كه باعث ايجاد تغييرات در آناليز فيبر نامحلول در شوينده ميشوند
نمونهگيري و جداسازي
در بيشتر اجزاء عموماَ محتواي فيبر ذرات بزرگ، بيشتر از ذرات كوچك هستند. بنابراين، هر فرآيندي كه نمونه را به ترتيب اندازه جدا كند (مثل لرزش در جريان حمل، آسياب و نمونهگيري تصادفي) ميتواند منجر به انتخاب نمونهاي شود كه از ميانگين حقيقي نمونه متفاوت باشد. يكي از موذيترين فرآيندهاي جداسازي آسيابكردن است. ذرات زمخت درازي كه در آسياب باقيمانده و در نهايت در حدي ساييده ميشوند كه از الك عبور ميكنند، داراي فيبر بالايي هستند. اگر آنها پاكشده يا از آسياب جارو شوند و جزء نمونه به حساب نيايند، خطا بوجود ميآيد. اگر آنها خرد شوند تا بالاخره عبور كنند، اما نمونه به دقت پس از آسياب مخلوط نگردد، اين هم يك خطاست زيرا آخرين مواد (پرفيبر) موجود در آسياب در بالاي نمونه قرار ميگيرند.
خشك كردن نمونه
وقتي پروتئينها و كربوهيدراتها ميتوانند اجزاء غيرمحلول تشكيل دهند (محصولات قهوهاي يا ميلارد) كه در حضور رطوبت در معرض حرارت بالا قرار گيرند. محصولات ميلارد به عنوان فيبر مصنوعي وليگنين در سيستم شوينده شناخته ميشوند. بنابراين نمونههاي خوراك هرگز نبايستي در معرض حرارتهاي بيش از 60 درجه در خشككن قرار گيرند و حداكثر 50 درجه ترجيح داده ميشود.
آسيابكردن نمونه
اصول روشهاي فيبر، عصارهگيري و محلولكردن اجزاء غيرفيبري ذرات خوراكي است.. انتظار ميرود كه بازده عصارهگيري به موازات كاهش اندازه ذرات افزايش يابد، چون محلول هاو حلالهاي شوينده ماتريكس كمي براي نفوذ در پيش رو دارند. علاوه براين، عصاره بر روي غشاءهاي متخلخل صاف ميشود كه نشان ميدهد كه ذرات ريز فيبر ممكن است از پسمانده شسته و خارج شده يا غشاءهاي فيلتر را مسدود كند. اين عوامل معلوم ميسازند كه چرا ريزتر آسيابكردن ريزتر نمونهها باعث پايينتر آمدن اعداد فيبر ميشود. ليكن، تعادلي بين ريز آسيابكردن براي افزايش بازده عصارهگيري و ريز آسيابكردن جهت پيشگيري از هدر روزی ذرات فيبر و مسدودشدن روزنههاي فيلتراسيون بايستي ايجاد شود. روش پيشنهادي آسياب Wiley را توصيه ميكند كه الكهاي mm1 دارد. آسيابهاي چکشی (Cyclone) توزيعي از اندازه ذرات ايجاد ميكنند كه از Wiley كوچكتر است حتي اگر همان الك استفاده شود، چون آسيابهاي چرخشي ذرات را با فشار از يك گوشه الك خارج ميكنند. با استفاده از الكهاي مشابه، اندازه ذرات در آسيابهاي چکشی نوع Udy به طور ميانگين نصف آسياب Wiley است كه منتج به اعداد فيبركمتر و مشكلات فيلتركردن بيشتر در جريان آناليز شويندهها ميشود.
استانداردسازي محلولها
براي به دست آوردن مقادير دقيق ADF و NDF ، هر دو محلول بايستي استاندارد باشند. اندازهگيري ADF بستگي به استفاده از اسيدسولفوريك 1نرمال دارد. نرماليته اسيد مورد استفاده براي شوينده اسيدي (AD) بايستي با استفاده از تيتراسيون آن در برابر يك استاندارد اوليه پايه مورد تاييد قرار گيرد. ما از TRIS يا THAM (تريس هيدروكسي متيل آمينو متان) به عنوان استاندارد پايه اوليه استفاده ميكنيم. يك محلول 00/1-9/0 نرمال از THAM (وزن كرده و نرماليته را تا 4 رقم اعشار محاسبه كنيد) ساخته و آن را در بورت بريزيد. با تقريب 01/0 ميليليتر، 10 ميليليتر از اسيد را در ظرف ريخته و با بهمزدن آن و استفاده از يك نشانگر pH، آن را تيتر كنيد. اگر محلول AD بين 99/0 تا 01/1 نرمال نباشد، نرماليته را با افزودن آب يا اسيد سولفوريك غليظ تصحيح كنيد.
محلول شوينده خنثي (ND) بايستي در pH 9/6 تا 1/7 استاندارد شود (دامنه ظريفتر 95/6 تا 05/7 ارجح است). اگر pH بيش از 2/0 از 7 فاصله دارد، محلولها را كنترل كنيد تا مطمئن شويد ماده شيميايي اشتباهاَ استفاده نشده و محلول را دور بريزيد. اگر pH بين 8/6-2/7 است، آن را با افزودن HCL يا NaOH براي رسيدن به 7 تصحيح كنيد. محلول ND اوليه ساخته شده توسط ونسوست حاوي 2 اتوكسي اتانول بود كه مشخص شد سمي است. از آن پس ترياتيلن گليكول جايگزين همان حجم از ماده مذكور شد. اين ماده شيميايي نبايستي ازمحلول ND حذف شود، زيرا به خارجشدن بعضي پسماندههاي غيرفيبري از بعضي خوراكها كمك ميكند. محلول آميلاز نيز كه به مقدار ml2 در دو مرحله جوش و فيلتراسيون اضافه ميشود، بايستي استاندارد باشد. مطمئن شويد كه 5/0 گرم سولفيت سديم قبل از جوشاندن به هر نمونه اضافه ميشود. چون براي خروج پروتئين از NDF مهم بوده و به خصوص در خروج از آلودگيهاي ازته از خوراكهاي پخته شده و حرارت ديده، محصولات فرعي حيواني و نمونههاي مدفوع يا digesta حياتي است.
مقدار نمونه
نسبت نمونه به محلول شوينده ميتواند تاثير كم، اما معنيداري در آناليز فيبر داشته باشد. روش استاندارد براي ADF يك گرم نمونه در 100 ميليليتر محلول AD است در حالي كه براي NDF 5/0 گرم نمونه در ml50 محلول ND است. انتخاب مقدار نمونه برآيندي از بازده عصارهگيري، هزينه محلول و خطاي اندازهگيري است. وقتي نسبت يكساني از نمونه به محلول حفظ گردد، نمونههاي بزرگ هزينه مواد را افزايش ميدهند. نمونههاي كوچكتر خطاي هر اندازهگيري را بزرگ ميكنند يعني اگر وزن پسمانده 001/0 گرم با خطاي 0002/0 گرم باشد، خطا 2% است. ليكن اگر وزن پسمانده تنها gr002/0 باشد همان خطا 10% ميشود. از آنجا كه ADF مقدار پسمانده كمتري دارد و پسمانده اغلب براي اندازهگيري ليگنين به كار ميرود، براي ADF نمونه بيشتري پيشنهاد ميشود.
خيساندن نمونهها قبل از جوش آوردن
بعضي آزمايشگاهها محلولهاي AD و ND را وزن كرده و يك شب قبل به نمونه ميافزايند. اين روش پيشنهاد نميشود. AD يك اسيد قويست و وقتي به مدت طولاني در معرض نمونه قرار گيرد بعضي اجزاء فيبري را تجزيه ميكند. سولفيت سديم محلول ND را ناپايدار ميسازد (به اين دليل به محلول اضافه نميشود) و خيساندن در ND بازده عصارهگيري را افزايش ميدهد. هميشه مواد شوينده را در زمان جوشاندن اضافه نماييد.
تغيير زمان و دماي جوشاندن
عصارهگيري فيبر محلول در شوينده وابسته به دما و زمان است. به موازات افزايش زمان و حرارت، پسمانده فيبري كاهش مييابد. براي هر دو روش، به خصوص ADF حياتي است كه زمان جوشاندن از شروع جوشش 60 دقيقه باشد. جوشاندن بايد در حرارتي باشد كه باعث حركت چرخشي ذرات نمونه شود. ما اجاقهايمان را طوري تنظيم ميكنيم كه 100 ميليليتر آب همدماي اتاق را در 34 دقيقه به جوش بياورد. يكي از بزرگترين جنبههاي ضعف تكنيك، انتقال ناقص همه باقيماندههاي فيبر از ظرف شيشهاي به كروزه Gooch يا كاغذ صافي است. بعضي اوقات آخرين بخش مانده در ته ظرف دور ريخته ميشود. مثلاٌ وقتي كه پس از ريختن آن به درون كروزه چيني سر ميرود.. پيشنهاد ميكنيم كه ظرف را به صورت خوابيده روي كروزه نگهداشته و جريان ضعيفي از آب داغ روي آن بگيريد تا تمامي ذرات به درون كروزه بروند. حداكثر دقت را به كار بريد تا محتواي ظرف در درون كروزه سرريز نشود. اغلب اين آخرين بخش حاوي مقادير قابل توجهي فيبر است، زيرا ذرات در جريان انتقال درون ظرف تهنشين ميشوند. انتقال بايستي آنقدر كامل باشد كه ظروف بين دوبار استفاده احتياج به شستشو نداشته باشند.
شستوشوي پسمانده با آب داغ و استون
معمولترين خطاي آزمايش فيبر شستشوي ناقص پسماندههاي فيبري جهت خارج كردن شوينده و اجزاء محلول خوراك است. ذرات خوراكي با حبابهايي پر ميشوند كه ميتواند محلولها و اجزاء را به دام بياندازد. با شستشوي ساده قسمت خارجي ذرات نميتوان اين حبابها را عاري از آلودگي كرد. قوانين اعمال تودهاي بايستي اعمال شوند تا مايعات داخل حبابها با آب تميز بيرون ذره به تعادل درآيند. اين فرايند وابسته به زمان است. بنابراين پسماندههای فيبري بايد هر بار حداقل براي مدت 2 دقيقه در آب تميز داغ 100-95 درجه خيسانده شوند تا تركيبات شوينده و محلول گير افتاده در درون حبابها، خارج شوند. اما پسماندههاي اغلب به جاي اينكه خيسانده شوند، شسته ميشوند. هرچه حجم آب و زمان خيساندن بيشتر باشد، عصارهگيري آلايندههاي محلول فيبر كاملتر خواهد بود. ما معمولاَ با 40 ميليليتر آب در 5 دقيقه شستشو را انجام ميدهيم.
به خصوص اين اهميت دارد كه تمامي ذرات ريز اسيد از پسمانده ADF و روزنههاي كاغذ صافي عبور كند.. در هنگام استفاده از كروزهها، بهتر است كه زيركروزهها نيز شسته شود، و با كاغذهاي صافي، صحيح آنست كه لبههاي كاغذ شسته شوند. اگر اسيد باقيمانده باشد، به لبههاي ذرات چسبيده و در جريان خشك شدن غليظ ميشود. اسيد غليظ فيبر يا كاغذ صافي را در 100 درجه نيمسوز خواهد كرد. نيمسوزشدن اكسيداسيون را بالا برده و باعث هدر رفتن مواد آلي شده كه وزن را كاهش ميدهد. در كروزه تنها فيبر هدر رفته و مقادير فيبر كمتر بدست ميآيد. اما وقتي كاغذ صافي استفاده شود، كاهش وزن ممكن از فيبر و كاغذ باشد. از آنجا كه اسيد به گوشههاي كاغذ نقل مكان ميكند، اكثراَ وزن كاغذ كم شده كه باعث ميشود اعداد فيبر بيش از حد واقعي برآورد شوند.
فيلتراسيون
چندين عامل در موثربودن و بهينهسازي فيلتراسيون پسماندههاي فيبر اهميت دارند. معمولاَ بايد كمترين مكش در هنگام فيلتراسيون صورت گيرد تا از گرفتگي غشاء فيلتر توسط پسمانده فيبر و از دسترفتن ذرات ريز جلوگيري شود. منبع مكش بايستي ثابت بوده و داراي ظرفيت ذخيرهسازي باشد. بعضي آزمايشگاهها به طرز موفقيتآميزي از مكندههاي آبي استفاده ميكنند، اما در آزمايشات ما اين وسيله قابل قبول نبوده است. ما از ديافراگمهاي پمپدار دو مرحلهاي با مخزن ذخيرهاي شيشهاي 18 ليتري و ذخيره مكش استفاده ميكنيم. همچنين اين نكته مهم است كه خطوط چندتايي و خطوط مكش درست (بسته) شوند تا حداقل تجمع كف را داشته باشيد. كف شديداَ تاثير مكش را در كروزهها كاهش خواهد داد.
ما يك manifold طراحي كردهايم كه نشت مكش و كف را در سيستم به حداقل ميرساند كه البته ارزان بوده و ساخت آن مقرون به صرفه است. اين manifold براي كروزههاي Gooch طراحي ميشود، ليكن ميتواند به راحتي براي استفاده در قيفهاي بوخنر يا قيفهاي كاغذي تغيير يابد. مکش زياد باعث می شود تا مقداري از ذرات ريز هدر بروند، اما غشاءهاي ظريف اغلب گرفته شده و فيلتراسيون را سخت ميكنند. اندازه روزنههاي بعضي سوراخهاي فيلتراسيونهاي معمول حاكي از پتانسيل تغييرات زياد در هنگام فيلتراسيون است:
|
اندازه روزنهها (ميكرومتر) |
نوع غشاء يا تخلخل |
|
220-170 |
صفحات چيني بسيار زبر، كروزههاي Gooch |
|
250-160 |
كروزههاي مخصوص P0 Fibertec |
|
150-90 |
كروزههاي مخصوص P1 Fibertec |
|
85-70 |
قيف بوخنر كاليفرنيا با الك آردي 200 |
|
90-40 |
كروزه استاندارد Fibertec P2 |
|
60-40 |
صفحه چيني زبر، كروزه Gooch (ml50)* |
|
40-14 |
كروزه مخصوص Fibertec P3 |
|
15-10 |
صفحه چيني متوسط، كروزه Gooch |
|
8 |
كاغذ صافي واتمن 40 |
|
5/5-4 |
صفحه چيني ظريف، كروزه Gooch |
|
7/2 |
فيلترهاي ميكروفيبر شيشهاي واتمن GF/D |
|
5/2-2 |
كروزههاي Gooch با صفحههاي چيني بسيار ظريف |
* كروزه پيشنهادي براي آناليز ADF و NDF
مشكلات صافكردن ميتواند از گرفتگي تدريجي صفحات چيني كروزهها بوسيله خاكستر، در اثر تکرارهاي متعدد نيز بوجود آيد. اگر اندازهگيري خاكستر براي تعيين فيبر بدون خاكستر لازم نباشد، در اولين قدم بايستي كروزهها را پس از هر بار استفاده تميز كرد. خاكسترگيري را به مدت 5 ساعت در 525-500 درجه انجام دهيد. از حرارتهاي بالا استفاده نكنيد وگرنه شيشه ذوب شده يا سطح صفحه چيني را لعاب ميگيرد. كروزهها را با يك محلول شوينده بشوييد. كروزه را درون آب قرار داده و به روش عكس مكش توسط مكنده در آن بدميد تا تميز شود.. يك درپوش روي كروزه قرار دهيد تا هوا در آنجا پر شده و آب را به طور معكوس به درون كروزه بكشد.
گاهي كروزهها با HCL 6 نرمال و يا يك محلول بازي شوينده حاوي 5 گرم ديسديم EDTA 50 گرم تريسديم فسفات و 200 گرم هيدروكسيد پتاسيم در يك ليتر آب شسته ميشوند. بايد اجازه داد تا كروزهها در هر دو محلول حدوداَ 30 دقيقه خيسانده شده و محلول بازي بايستي همراه با حرارت استفاده شود. محلول بازي ممكن است كروزه را ضعيف كند، بنابراين فقط مواقعي كه كروزه به خوبي كار نميكند استفاده ميشود. سرعت فيلتر شدن با اندازهگيري زمان عبور 50 ميليليتر آب بدون خلاء اندازهگيري ميشود كه بايستي حدوداَ 180 ثانيه وقت بگيرد. اگر كمتر از 120 ثانيه طول بكشد، كروزه را چك كنيد تا مطمئن شويد ترك نداشته يا نشكسته است. اگر بيش از 240 ثانيه طول بكشد، آن را با اسيد شسته و دوباره امتحان كنيد اگر باز هم از 240 ثانيه بيشتر شد آن را با قليا بشوييد. اگر تصحيح نشد آن را دور بيندازيد.
خشككردن و توزين پسماندههاي فيبري
پسماندههاي استون را بايد تا آنجا كه امكان دارد با مكش به طور كامل خارج كرد. توصيه ميكنيم قبل از قراردادن پسمانده در آون، جهت تبخير استون، آن را نزديك آون يا روي آن قرار دهيد. همچنين توصيه ميشود تمامي نمونهها در زمان واحد و در انتهاي يك روز در آون قرار داده شوند. اين عمل باعث ميشود تا رطوبت نمونهها، به نمونههايي كه قبلاَ در آون خشك شدهاند، منتقل نشود. نمونهها بايستي در 105-100 درجه آنقدر بمانند تا وزن ثابتي بگيرند. معمولاَ اين زمان 8 ساعت يا يك شب است.
تكنيك توزين جهت بدست آوردن وزن خشك نمونهها و پسماندهها بسيار حساس است. توصيه ميكنيم كه از تكنيك توزين داغ استفاده شود، زيرا كه دقيقتر و مطمئنتر است (براي نمونهها هيگروسكوپيك مثل پسماندههاي فيبر خشك). توزين داغ سريعتر بوده، به نگهداري كمتري نياز داشته و كمتر در معرض خطاهاي استفاده از دسيكاتور است. اگر نمونههاي زيادي در يك زمان در دسيكاتور قرار داده شوند، اگر تاي نمونهها در جريان انتقال از آون يا توزين باز شود، يا اگر ماده سردكننده در دسيكاتور از نوع نامرغوب بوده يا مرتباَ عوض نشود، وزن خشك بدست آمده از دسيكاتور بدون توجه به دماي آون يا زمان خشكشدن داراي خطاست. ما معمولاَ نمونهها را به مدت يك شب خشك كرده و مستقيماَ آن را با استفاده از يك صفحه تفلون به ترازو انتقال داده و توزين ميكنيم تا گرماي نمونهها به تابه ترازو منتقل نشود.
تعيين فيبر در نمونههاي سخت صاف شونده
هر نمونهاي كه تحت مكش بيش از 10 دقيقه زمان براي صاف شدن ببرد، را بايستي دور ريخت. زيرا نتايج دقيق نخواهند بود. در عوض، نمونهها، را با استفاده از روش تغيير يافته NDF دوباره آماده كنيد. چندين تغيير را ميتوان روي يك يا همه نمونهها سخت صاف شونده اعمال كرد:
1. مقدار نمونه را به 3/0 گرم كاهش دهيد. اين عمل خطاي توزين را بالا خواهد برد، اما معمولاَ بهترين راهكار براي نمونههاي مشكلساز است.
2. از كمك صافي استفاده كنيد. پشم شيشه (حدوداَ 25/0 گرم) يا صافيهاي تودهاي ميكرو فيبر شيشهاي (واتمن GF/D، Cm25/4)، جلوي گرفتگي مواد ژلاتينه و خاكستر را در كروزههاي چيني ميگيرد. صافيهاي تودهاي گران هستند. اما بعضي اوقات تنها وسيله بدست آوردن NDF هستند.
3. كروزه چيني را با خارجكردن و دوباره جاسازي آن به درون back-pluchT holder كنيد تا هوا مجبور شود تا از درون صفحه چيني به عقب برگردد.
نمونههاي پرنشاسته
اگر صافكردن مشكل است، محلول استاندارد آميلاز بيشتري تزريق كنيد، خيلي اوقات اين كار به بازشدن صفحه چيني و صافشدن كمك خواهد كرد. در اغلب موارد تغيير روش اصلي NDF به روشي كه از آميلاز بهره ميبرد، اين مشكل را مرتفع ساخته است.
نمونههاي پكتيندار، لزج و گليكوپروتئين
نمونهها بايد در هنگام صافشدن داغ باشند. زمان خيساندن را به حداقل رسانده و آب را داغ نگهداريد. كروزه را قبل از صافشدن داغ كنيد، اجازه ندهيد تا پسماندهها قبل از انتقال به كروزه در ظرف رسوب كند، در عوض هرچه سريعتر آن را انتقال دهيد. اضافهكردن استون قبل از عبور همه آب (كمتر از ml5 آب در صافي باقيمانده باشد) ميتواند بعضي نمونهها را پاك كند، اما به ياد داشته باشيد استون تمامي مواد شوينده باقيمانده را در پسمانده رسوب ميدهد.
نمونههاي پرچربي
نمونهها را با استون قبلاَ عصارهگيري كنيد تا قبل از آناليز فيبر مقداري از چربي آن خارج شود. به اين منظور، نمونهها را در كروزه از قبل وزن شدهاي كه براي NDF استفاده ميشود، وزن كنيد. 40-30 ميليليتر استون اضافه كرده و اجازه دهيد تا نمونهها 5 دقيقه خيسانده شوند و گاه گاه آن را تكان دهيد. استون را با مكش خارج كرده و سه بار ديگر عصارهگيري با استون را تكرار كنيد. پس از آخرين بار نمونه را مكش كرده تا خشك شود و آن را به ظرف جوشاندن NDF منتقل كنيد. روش NDF را انجام دهيد و براي صافشدن آن را به كروزه عصارهگيري ليپيد بازگردانيد. براي خارج كردن تمامي مواد محلول در ND كه ممكن است در كروزه باقيمانده باشد، آن را در يك ظرف شيشهاي دردار داغ با محلول ND بريزيد
نمونههاي پرخاكستر، مدفوع يا مواد هضمي (Digesta)
به خصوص فيلتر كردن نمونههاي مدفوع، مشكلساز است. به نظر ميرسد مواد ريز اين نمونهها پرزهاي روزنههاي صافي را گرفته و از صافشدن و مكش جلوگيري ميكنند. معمولاَ صافيهاي ميكروفيبر براي تعيين NDF اين نمونهها لازم است. همچنين صافشدن را ميتوان با تهنشين كردن مواد به مدت 60 ثانيه در ظرف جوش پس از پايينآوردن آن از واحد جوش و سرريزكردن آرام و با دقت مايع از ظرف كمي افزايش داد به طوري كه حداقل انتقال مواد از ظرف به كروزه رخ دهد. اين به انتقال آرام مايع تحت مكش به صورتي كه تمامي سطح توده صافي را نگيرد كمك ميكند. اگر در مرحله شستشو نمونهها گرفتگي ايجاد كنند، به آرامي سطح توده را خراش دهيد تا سطح جديدي براي فيلتراسيون ايجاد شود. حداقل مكش و صبور بودن در جريان مرحله انتقال در نيل به نتايج دقيق در اين نمونهها اهميت دارد.
تعيين NDF توسط آميلاز
منابع
Georing, M. K. and P. J. Van Soest. 1990. Forage fiber analysis: apparatus, reagents, procedures and some applications). USDA Agricultural research service. Handbook no. 379 as modified by D.R. Mertens (1992, pesonal communication).
Van Soest P. J, J. B. Robertson, and B. A. Lewis. 1991. Methods for dietary fiber, neutreal detergent fiber and nonstarch polysacharides in relation to animal nutrition. J. Dariy Science. 47: 3583-3543
Mertens, D. R. 1992 Critical Conditions in determining detergent fiber. Proceedings of NFTA forage Analysis workshop Denvor. Co. pp. Cl-C8.
هدف
اين روش براي تعيين NDF در همه انواع علوفهها و خوراكها كاربرد دارد.
اصول اصلي
محلول شوينده خنثي جهت حل كردن پكتينهاي سهلالهضم و محتويات سلول گياهي (پروتيئنها، قندها و چربيها)، استفاده شده كه يك باقيمانده فيبري از آن بر جاي ميماند (aNDF) كه عمدتاَ اجزاء ديواره سلولي گياهان (سلولز، هميسلولز و ليگنين) است. شوينده جهت محلول كردن پروتئينها و سولفيت سديم نيز براي كمك به خروج بعضي مواد نيتروژني بكار ميرود، EDTA جهت كليتكردن كلسيم به كار ميرود تا پكتينها را در درجه حرارت جوش خارج كند، ترياتيلن گليكول به خروج بعضي مواد غيرفيبري در خوراكهاي كنسانترهاي كمك كرده و آميلاز مقاوم به دما براي خارجكردن نشاسته استفاده ميشود. دو نحوه افزودن آميلاز (يكي در جريان جوشاندن و ديگري در هنگام فيلتراسيون جهت كمك به آناليز aNDF و كاهش مشكلات فيلتراسيون) استفاده شده است. آميلاز مقاوم به حرارت به منظور غيرفعالكردن آنزيمهاي آلوده شده احتمالي كه ميتوانند اجزاء فيبري را تجزيه كنند در محلولهاي داغ بكار گرفته ميشود.
تجهيزات
وسايل جوشاندن، بشر آزمايشگاهي (600ml) ، شيشه چيني (Gooch)، كروزه (تخلخل بالا، ml50( ترازوي الكتريكي آزمايشگاهي با دقت 1/0 ميليگرم، وسيله مكنده فيلتركننده با دريچههاي خطي جهت شكستن خلاء و آون خشك آماده شده در 100 درجه.
محلولها
محلول شوينده خنثي
براي ساخت حدوداَ 18 ليتر از مخلوط آن:
82/17 ليتر آب مقطر، 540 گرم سديم لوريل سولفات، 335 گرم EDTA ، نمك ديسديم (ميتواند حاوي 72 گرم NaoH و 263 گرم از اسيد آزاد EDTA به عنوان يك جايگزين ارزانتر باشد)، 6/122 گرم سديم بورات دكاهيدرات (Na2B4O7.10H2O) 1/82 گرم فسفات سديم ديبازيك (Na2HPO4) بدون آب، 180 ميليليتر ترياتيلن گليكول (درجه محلولي)
آمادهسازي محلول aNDF
نصف آب مقطر را در ظرف مخلوط كننده بريزيد. آن را در صفحه همزن زير هود گذاشته و شروع به همزدن نماييد. محلولهاي باقيمانده را غير از ترياتيلن گليكول اضافه نماييد. (هشدار: در هنگام توزين و حمل سديم لوريل سولفات ماسك بزنيد). به آرامي آب مقطر باقيمانده را اضافه كرده تا كف شوينده را محدود كند. وقتي حدوداَ 75 درصد از آب مقطر اضافه شد، ترياتيلن گليكول را اضافه نماييد. ترياتيلن گليكول كف محلول شوينده را كاهش خواهد داد. اجازه دهيد تا يك شب هم خورده شود. اگر مواد حل نميشوند از صفحه همزدن اجاق دار استفاده كنيد. جهت اجتناب از رسوب دادن محلول آن را در 20 درجه يا بالاتر نگهداريد. در نظر داشته باشيد كه pH محلول بايستي بين 95/6 تا 05/7 باشد. اگر در اين محدوده نبود آن را با HCL يا NaOH به pH لازم برسانيد.
محلولها، سديم سولفيت بيآب (Na2So3) ، استن، و آلفا – آميلاز مقاوم به حرارت.
ملاحظات ايمني
استون به شدت قابل اشتعال است. اجازه ندهيد تا بخار آن در محيط تجمع يابد. از يك وسيله موثر خروج بخار استفاده كنيد. از تماس با دست نيز اجتناب كنيد. قبل از قراردادن پسمانده در آون اطمينان حاصل كنيد كه تمامي ذرات استون بخار شده است. سديم لوريل سولفات غشاءهاي موكوسي را خراش ميدهد. از ماسك و دستكش در هنگام كار استفاده كنيد.
روش كار
1. نمونهها بايستي در آون 55 درجه تا بيش از 85 درصد ماده خشك، خشك شوند. سپس آنها را از يك الك 1 ميليمتري آسياب كنيد.
2. يك ليوان چيني ml50 را خشك كرده و يك جا شب در 100 درجه نگهداشته و آن را به صورت داغ وزن كنيد (W1) ، وزن را با تقريب 1/0 ميليگرم كنترل كنيد.
3. نمونهها را به آرامي مخلوط كرده و حدود 45/0 تا 55/0 گرم از آن را با تقريب 1/0 ميليگرم در يك ظرف ml600 وزن كنيد. يك نمونه ديگر جهت تعيين ماده خشك آن وزن كنيد.
4. به واحد عصارهگيري (reflux) يك گرماي اوليه بدهيد تا حرارت آن به حدي برسد كه محلول شوينده حدوداَ در ظرف 5 دقيقه به جوش بيايد.
5. با استفاده از قاشقي كه قبلاَ كاليبره شده است 5/0 گرم سولفيت سديم به آن اضافه كنيد.
6. 50 ميليليتر از محلول شوينده خنثي اضافه كرده و ظرف را آنقدر بچرخانيد تا نمونه و سولفيت سديم كاملاَ غوطهور شوند.
7. ظرف را روي اجاق گاز و زير كندانسور آب سرد قرار دهيد. نمونهها بايد طي 4 تا 5 دقيقه به جوش آيند. معمولاَ نمونهها براي مدت 1 الي 2 دقيقه قوياَ كف ميكنند. در اين زمان درجه حرارت را پايين نياوريد.
8. پس از 5 دقيقه، ظرف را از واحد جوش برداشته و 2 ميليليتر محلول استاندارد آميلاز اضافه كنيد.
9. ظرف را تكان دهيد تا آميلاز به آرامي در محلول شوينده خنثي مخلوط گردد و تمامي ذرات چسبيده شده به كنارههاي ظرف را دوباره در محلول غوطهور كنيد. وسيلهاي كه ذرات چسبيده شده را به داخل ظرف باز ميگرداند با محلول شوينده خنثي بشوييد.
10. ظرف را به واحد جوش برگردانيده و اجازه دهيد تا جوش بيايد. 60 دقيقه آن را بجوشانيد. 5 تا 10 دقيقه پس از افزودن آميلاز، كنارههاي ظرف را با محلول شوينده خنثي بشوييد.
11. نمونهها را از واحد جوش خارج كرده و اجازه دهيد تا 60-30 ثانيه قبل از فيلتراسيون سرد شوند.
12. كروزههاي چيني را جهت فيلتراسيون با افزودن 40 ميليليتر آب جوش داغ كنيد. و آب را با خلاء خارج كنيد.
13. با دقت 40-30 ميليليتر اوليه محلول را از ظرف به كروزه سرازير كنيد. لبه ظرف را جهت جلوگيري از بيرون ريختن مواد بشوييد. ظرف را در موقعيت سرازير نگه داريد تا خالي شود. محلول را با حداقل مقدار خلاء خارج كنيد.
14. خلاء را ببنديد و پسمانده را از ظرف به درون شيشه با استفاده از يك جريان ملايم آب جوش بشوييد. حداقل خلاء را جهت فيلتراسيون به كار بريد.
15. بلافاصله نيمي از كروزه را با آب داغ پركنيد و 2 ميليليتر از محلول استاندارد آميلاز به آن اضافه كنيد و اجازه دهيد تا 45 تا 60 ثانيه واكنش انجام گيرد در اين فاصله ذرات باقيمانده از ظرف را بشوييد.
16. نمونه را با افزودن 30 تا 40 ميليليتر آب جوش به پسمانده موجود در ظرف چيني دوباره بشوييد و هر بار اجازه بدهيد تا 2 دقيقه خيس باشد.
17. نمونه را دوبار با استون (cc30) شسته و هر بار دو دقيقه فاصله ايجاد كنيد.
18. كروزه را در 100 درجه به مدت 8 ساعت يا يك شب خشك كرده و به صورت داغ با تقريب mg1/0 وزن كنيد (W3).
نكات
qفيلتراسيون مشكل ممكن است به علت گرفتگي كروزههاي شيشهاي متخلخل باشد. كروزهها بايستي به طور منظم با اسيد يا باز شسته شوند. سرعت فيلتراسيون كروزهها بايد حتيالامكان بين نمونهها يكسان باشد. جهت چككردن سرعت آنها را پر از 50 ميليليتر آب كرده و سرعت فيلتراسيون بدون خلاء را محاسبه كنيد. اين بايد حدود 180 ثانيه باشد. اگر بيش از 240 ثانيه بود، كروزهها بايستي تميز شوند. اگر كروزهها در كمتر از 120 ثانيه خالي ميشوند، ترك يا سوراخهاي كف آن را بررسي كنيد.
q خلاء مناسب، جهت فيلتراسيون حياتي است. خلاء بايستي جهت خروج سريع محلول موثر باشد اما نه آنقدر كه ذرات فيبري باعث گرفتگي شيشه شوند.
q آب شستشو بايستي بالاي 95 درجه باشد. به خصوص اين موضوع در مورد نمونههاي حاوي ذرات پكتيكي بالا (لزج)، سيلاژها و گليكوپروتئينها صادق است.
q بعضي از نمونهها هميشه مشكل فيلتراسيون دارند (سيلوي ذرت، تفاله مركبات، كنجاله آفتابگردان، پودر گوشت و مدفوع). تجربه نشان داده است كه هر نمونهاي كه بيش از 10 دقيقه وقت براي فيلتراسيون بگيرد، نتايج غيرمعتبري داده و بايستي با استفاده از تغييراتي كه توسط مرتنز و ون سوست تشريح شده است، تكرار شود.
q بسياري از عصارههاي آميلازي، مخلوطهاي خامي هستند كه ممكن است حاوي آنزيمهاي تجزيه كننده فيبر باشند. از آنجا كه گرما آنزيمهاي آلوده را غيرفعال ميكند، پيشنهاد ميشود كه يك آنزيم آميلاز مقاوم به گرما در محلول داغ مورد استفاده قرار گيرد.
محاسبه : درصد NDF آميلازي (aNDF)
aNDF (DM basis)=W3-W1/W2xDM%
W1 = وزن كروزه به گرم W2 = وزن اوليه نمونه بر گرم W3 = وزن خشك كروزه و فيبر خشك به گرم 1 ميانگين انحراف استاندارد بين تكرارهاي NDF آميلازي بين 225/0± در نمونههاي با 40 درصد NDF و 6/0± در نمونههايي با 70 درصد NDF است كه منجر به حد بحراني (S2) با دامنه 2/1 تا 7/0± و حدكنترل (SD3) با دامنه 80/1 تا 05/1± ميشود. نتايج را در يك نمودار رسم كرده و روند آن را رسم كنيد. نتايج بالاتر يا پايينتر از حد بحراني SD2± (95 درصد حد اطمينان)، دلالت بر مشكلاتي در سيستم آناليز دارند. نتايج خارج از حدكنترل SD3± (69 درصد حداطمينان)، حاكي از عدم كنترل بوده و نتايج بايستي دور ريخته شوند. دو آناليز پشت سرهم كه در يك طرف ميانگين بين حدبحراني (SD2±) و كنترل (SD3±) قرار گيرد نيز حاكي از فقدان كنترل است.
مدیریت : طوسی 09155100051